一、立式显微镜
(一)明视野观察(Bright field)
明视野显微镜是一种众所周知的显微镜检查方法,广泛应用于病理学和检验学中观察染色切片。所有显微镜都可以执行这一功能。这里就不赘述了。
(2)暗场观察(暗场)
暗视野其实就是暗场照明。其特点与明视场不同,即不直接观察照明光,而是观察被检物体反射或衍射的光。因此,视场变成暗背景,而被检查的物体呈现明亮的图像。
暗视野的原理是基于光学中的廷德尔现象。强光直射时灰尘是肉眼无法观察到的,这是强光衍射造成的。如果光斜入射到它上面,由于光的反射,粒子的体积似乎增加了,变得肉眼可见。
暗场观察需要的一个特殊附件是暗场聚光镜。其特征是不允许光束自下而上穿过被检物体,而是改变光束的路径,使其斜向射向被检物体,使照明光不直接进入物镜,利用被检物体表面反射或衍射光形成的亮像。
暗场观测的分辨率远高于明场观测,可达0.02-0.004毫米
(3)相衬显微术(Phase contrast)
在光学显微镜的发展中,相差显微镜的成功发明是现代显微镜技术的一项重要成就。我们知道,人眼只能分辨光波的波长(颜色)和振幅(亮度)。对于无色明亮的生物标本,当光线通过时,波长和振幅变化很小,因此很难在明视野下观察标本。
相衬显微镜是利用被检物体的光程差进行显微检查,即有效利用光的干涉现象,将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差,即使无色透明的物质也能清晰可见。这大大方便了对活细胞的观察,所以相差显微镜被广泛应用于倒置显微镜。
相衬显微镜不同于设备中的明视场,有一些特殊要求:
1.环形狭缝:安装在聚光镜下方,与聚光镜组合成一个全相位对比聚光镜。它由安装在圆盘上的不同尺寸的环形隔膜组成,标有10X、20X、40X、100X等字样。在外侧,与相应倍数的物镜结合使用。
2.相位板(Phase plate):安装在物镜的后焦面,分为两部分。一部分通过直射光,是半透明的环,叫共轭面;另一种是通过衍射光的部分,称为“补偿面”。带相位板的物镜称为“相衬物镜”,外壳上常写有“Ph”字样。
相差显微镜是一种复杂的显微镜检查方法,为了获得良好的观察效果,调试显微镜是非常重要的。除此之外,还要注意以下几个方面。
1.光源要强,所有孔径光阑都要打开;
2.用滤色片使光波接近单色;
(4)微分干涉称为显微检查(微分干涉对比DIC)
微分干涉显微镜出现于20世纪60年代。既能观察无色透明的物体,又能表现出强烈的立体感。它具有相衬显微术所不能达到的一些优点,观察效果更加逼真。
1.原则
差分干涉显微镜使用一种特殊的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分离光束的振动方向相互垂直,强度相等,光束在两个接近点通过被检物体,相位略有不同。由于两束光的分裂距离极小,没有鬼影现象,所以图像呈现出立体感。
2.差分干涉显微术所需的特殊部件:
(1)偏光镜
(2)分析仪
(3)两个渥拉斯顿棱镜。
3.微分干涉标尺显微检验中的注意事项
(1)由于差动干涉衬片的高灵敏度,胶片表面不能有污垢和灰尘。
(2)具有双折射的材料不能达到微分干涉衬层显微术的效果。
(3)微分干涉衬片应用于倒置显微镜时,不能使用塑料培养皿。
(5)透视检查
荧光透视法是用短波长的光照射被荧光素染色的被检物体,然后激发产生长波长荧光,再进行观察。荧光显微术广泛应用于生物学、医学等领域。1.透视一般分为透射和入射两种。
(1)透射式:激发光来自待测物体下方,聚光器为暗场聚光器,使激发光不进入物镜,而荧光进入物镜。它在低功率下很亮,但在高功率下很暗。浸在油里调整的时候很难操作,尤其是低倍光照范围很难确定,但是可以得到很暗的背景。透射类型不用于不透明的被检查对象。
(2)事件型:传播型目前几乎已经被淘汰。大多数新型荧光显微镜是入射型的。光源来自被检物体上方,光路中有分光镜,因此对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起聚光镜的作用,不仅操作简单,而且可以实现从低倍到高倍的全视场均匀照明。
2.荧光显微镜的注意事项
(1)长时间照射激发光,荧光会衰减淬灭。所以观察时间要尽量缩短。当暂时观察不到激发光时,应使用挡板遮挡激发光。
(2)油镜观察应使用“非荧光油”。
(3)荧光几乎很弱,应在暗室中进行。
(4)电源最好配有稳压器,否则不稳定的电压不仅会降低汞灯的使用寿命,还会影响显微镜检查的效果。
目前,许多新的生物学研究领域都应用于荧光显微镜,如基因原位杂交(FISH)等。
二、偏光显微镜(偏光显微镜)
(一)偏光显微镜的特点
偏光显微镜是一种识别物质精细结构光学性质的显微镜。在偏光显微镜下,所有具有双折射的物质都可以清楚地区分。当然,这些物质也可以通过染色来观察,但有些是不可能的,必须使用偏光显微镜。
偏振光显微镜的特点是将普通光变成偏振光进行显微镜检查,从而鉴别一种物质是单折射(各向同性)还是双折射(各向异性)。
双折射是晶体的基本特性。因此,偏光显微镜广泛应用于矿产、化工等领域。它在生物学和植物学上也有应用。
(2)偏光显微镜的基本原理
偏光显微镜原理比较复杂,这里就不介绍了。偏光显微镜必须具备以下配件(a)偏光镜(b)检偏器(c)专用无应力物镜(d)旋转载物台。
(3)偏光显微镜法
1.Orthscope:又称无畸变显微镜,其特点是用低倍物镜代替Bertrand透镜,推动聚光镜的上透镜,使照明孔径变小。
正相显微镜用于检查物体的双折射。
2.锥镜:也称为干涉显微术,这种方法用于观察物体的单轴或双轴性质。
(4)偏光显微镜对设备的要求
1.光源:最好用单色光,因为光的速度、折射率、干涉现象因波长不同而不同。普通光可用于一般的显微镜检查。
2.目镜:带有十字准线的目镜。
3.聚光镜:为了获得平行偏振,应该使用可以推出上透镜的外摆式聚光镜。
4.Bertrand镜头:这是一个辅助镜头,把物体引起的初级相位放大成次级相位。
(5)偏光显微镜的要求
1.载物台的中心与光轴同轴。
2.偏振器和分析器应该处于正交位置。
3.制作不要太薄。
三、倒置显微镜(Inverted microscope)
以上是立式显微镜的镜检方法,主要用于切片的观察。倒置显微镜用于生物、医学等领域的显微观察,如组织培养、体外细胞培养、浮游生物、环境保护、食品检验等。
由于上述样品特性的限制,被测物都放在一个培养皿(或培养瓶)中,这就要求倒置显微镜的物镜与聚光镜之间的工作距离很长,可以直接用显微镜观察和研究培养皿中的被测物。因此,物镜、聚光镜和光源的位置是颠倒的,所以称之为“倒置显微镜”。
由于工作距离的限制,倒置显微镜物镜的最大放大倍数为60X。一般研究用的倒置显微镜都配有4X、10X、20X、40X的相位差物镜,因为倒置显微镜多用于无色透明的活体观察。如果用户有特殊需求,还可以选择其他附件进行差分干涉、荧光和简单偏振的观察。
目前,倒置显微镜广泛应用于膜片钳、转基因ICSI等领域。
四。立体显微镜(立体显微镜)
体视显微镜又称“立体显微镜”或“解剖显微镜”,是一种具有立体感的视觉仪器,广泛应用于生物学、医学、农业、林业、工业和海洋生物学等领域。它具有以下特点:
1.双目镜筒中的左右光束并不平行,而是有一定的夹角——体积视角(一般为12 ~ 15度),所以成像有立体感;
2.像是直立的,便于操作和解剖,因为目镜下面的棱镜把像颠倒了;
3.虽然放大倍数不如常规显微镜,但工作距离很长。
4.焦深大,便于观察被检物体的全层。
5.视场的直径很大。
目前,立体反射镜的光学结构是:一个普通的初级物镜,对物体成像后的两束光被两组中间物镜——变焦透镜分离,然后由各自的目镜以集成的视角成像。它的放大倍数变化是通过改变中间透镜组之间的距离来获得的,所以又叫“变焦-立体显微镜”。
随着应用需求,目前立体镜可以配备多种可选配件,如荧光、摄影、摄像机、冷光源等。